血浆蛋白的浓度跨度范围及其广，从高丰度白蛋白、免疫球蛋白等的mg/ml，到白介素、干扰素等细胞因子的pg/ml，很难用单一的技术可以将这些蛋白都能同时检测到，特别是考虑到低丰度蛋白的鉴定和检测（图1）。

怎样才能全面的对血液蛋白组进行检测，筛选重要的潜在标志物呢？今天银河国际就以近期发表的一篇相关文章为例，分享血液蛋白标志物的优选解决方案，以飨读者！

图1 血浆蛋白浓度范围(Schiess et al. Mol Oncol. 2009)

近期Cell杂志发表了一项题为“A blood atlas of COVID-19 defines hallmarks of disease severity and specificity”的研究¹，该研究利用多组学技术诠释了COVID-19的外周血特征。该研究纳入了100多名住院的COVID-19患者，以及康复期的社区COVID-19病人，健康者，重症的流感患者和脓毒症患者。其中住院的COVID-19病人依据WHO的分类标准分为了中度、重度、危重度三个程度。研究者利用质谱流式（CyTOF）、CITE测序、转录组测序、单细胞测序、BCR和TCR测序、4D蛋白组TimsTOF质谱技术和Luminex细胞因子检测技术分析了COVID-19病人外周血特有的细胞组成和分子特征，通过WGCNA分析、机器学习进行特征变量选择等算法以及多组学整合分析方法鉴定了与COVID-19疾病严重程度密切相关的免疫细胞亚群、关键的基因和蛋白以及重要的生物学过程和通路，为COVID-19疾病的精准治疗提供了重要的参考依据（图2）。

图2 COVID-19疾病的血液多组学研究

这项研究利用了质谱技术和抗体芯片技术开展血清/浆蛋白组学的分析。研究者首先通过4D蛋白组平台TimsTOF Pro质谱仪 (Bruker Daltonics)分析了来自257个受试者总共340份血浆样本。质谱结果表明血浆蛋白组可以依据疾病的严重程度将样本分开（图3A），疾病的严重性与急相反应蛋白、补体系统蛋白密切相关，例如SAA1, SAA2, CRP, C5, C6, C9, CFB, SERPINA3, SERPINA1, ITIH3, APC等蛋白（图3B）。蛋白互作网络分析展示了参与胆固醇转运（cholesterol transport）和 纤维蛋白血凝(fibrin blood clots)的成员分别形成了2个最大的蛋白簇（图3C）。说明了这些生物学过程与COVID-19疾病的严重程度非常相关。之后研究者利用Luminex技术检测了血清/浆中51个细胞因子和趋化因子。结果表明了25个因子在COVID-19病人和健康人间存在显著性差异，其中CCL2, CCL19, CCL20, CXCL10, GM-CSF, IL-6, IL-8, IL-15, S100A9, SCGF与住院COVID-19病人的严重程度高度相关（图3D）。进一步的蛋白和临床指标相关性网络分析展示了几个临床特征与网络中心的节点蛋白呈现很强的相关性，包括GM-CSF, CXCL10, TREM-1, CCL2/19, TF, IL-6/15, MPO, S100A9蛋白（图3E）。

图3 4D质谱和芯片技术分析血浆蛋白组

研究者又利用相似网络融合的方法（Similarity Network Fusion, SNF）整合质谱数据和芯片数据对住院COVID-19病人进行亚型分类（图4A）。结果很明显可以将病人分为两个亚群，并且这两个亚群也可以通过临床指标区分（图4B），例如吸氧浓度和SOFA分数，亚群1疾病严重程度低，亚群2疾病严重程度高（图4C）。与之一致的，这两个亚群的病人与28天死亡率密切相关，亚群1有低的死亡率，而亚群2有高死亡率（图4D）。这些结果说明了血清/浆蛋白组可以作为COVID-19病人预后的标志物。最后研究者鉴别了区分两个亚群最主要的11个蛋白，包括IL-6, IL-8, CCL2, CCL19, CCL20, CXCL10, S100A9, SAA1, SERPINA3, GM-CSF, CLEC11A。

银河国际将质谱技术和抗体芯片技术有机组合，实现血液标志物的全方位的检测！

图4 基于血浆蛋白组的疾病分型

 研究者又进行了多组学的整合分析，通过机器学习算法鉴定了预测疾病严重程度的潜在标志物，发现了具有高效能的预测标志物组合，包括SAA2, CRP, IGHG4, CL20, CCL2, IL-6和C5a蛋白（图5A,B）。研究者最后利用阵列稀疏分解（SDA）算法发现了很多与疾病严重程度相关的模块，这些模块由不同的细胞亚群、基因和蛋白组成（图5C）。例如其中一个与COVID-19疾病严重程度最相关模快组成包括增加的血浆趋化因子CXCL8, CXCL10, CCL20和GM-CSF，及急相反应蛋白SAA1/2, SERPINA3, LRG1 和LBP; 减少的中间单核细胞; 高表达的分子伴侣CLU基因和甲基转移酶METTL7B基因；下调的lgE受体基因和多个HLA-II基因；与抗原呈递、TCR信号和哮喘相关的富集通路等（图5D）。最后还鉴别了相对于脓毒症和流感疾病，COVID-19相关的一些特有的模块，总之这些结果说明了通过蛋白组、转录组、单细胞等多组学分析可以鉴定COVID-19疾病严重程度和特异的相关血液特征，为理解COVID-19疾病的病理机制，鉴定诊断和预测标志物及精准治疗提供重要依据。

|   总结与结论

目前常用的两种血浆蛋白检测技术是质谱技术和基于抗体的检测技术。对于质谱技术，血浆高丰度蛋白会掩盖和干扰低丰度蛋白的观察。但是多种样本预处理方法的应用及质谱技术的升级可以在一定程度上解决上述问题。例如质谱检测前预先去除血浆10多种高丰度蛋白，采用数据非依赖的采集模式（DIA）实现肽段全范围的扫描，特别是伴随着4D蛋白组时代的到来，质谱的检测灵敏度、准确度和覆盖深度得到了跨时代的提升。这些高精度的质谱技术已经逐渐成为血浆标志物发现和鉴定的重要手段。基于抗体的检测技术包括各种固相抗体芯片及Luminex液相悬浮芯片等，这些芯片依赖于使用的抗体，可以检测那些低丰度的蛋白，而无需去除高丰度蛋白，特别适用于检测血液中含量相对低的炎症因子、生长因子、趋化因子和神经因子等。质谱和抗体芯片两种技术可以优势互补，两者结合无疑可以丰富鉴定的蛋白数量，发现更多潜在的标志物。

银河国际一直致力于血液蛋白标志物的研究和服务，凭借多年经验及先进的检测平台可以为大家提供系统化的血液标志物解决方案。就蛋白组而言，除了常规的技术，银河国际还拥有目前最先进的4D-DIA质谱检测平台，并且是4D蛋白组“双平台”，可满足不同研究的需求。对于血液低丰度的细胞因子，银河国际拥有“高通量抗体芯片”、“Luminex液相悬浮芯片”、“单分子高敏Simoa技术”三个细胞因子检测平台，可以同步检测几十至几千个因子，检测灵敏度可以达到fg级（Simoa）。

银河国际将质谱技术和抗体芯片技术有机组合，实现血液标志物的全方位的检测！

|   参考文献

1.COvid-19 Multi-omics Blood ATlas (COMBAT) Consortium. A blood atlas of COVID-19 defines hallmarks of disease severity and specificity. 2022. In Press.